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Nature Communications volume 13, número do artigo: 7962 (2022) Citar este artigo

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A atividade d, d-transpeptidase das proteínas de ligação à penicilina (PBPs) é o alvo primário bem conhecido dos antibióticos β-lactâmicos que bloqueiam a polimerização do peptidoglicano. A morte bacteriana induzida por β-lactâmicos envolve respostas complexas cujas causas e consequências são difíceis de resolver. Aqui, usamos a substituição funcional de PBPs por uma l, d-transpeptidase insensível a β-lactama para identificar genes essenciais para mitigar os efeitos da inativação de PBP por β-lactâmicos em bactérias em divisão ativa. As funções dos 179 genes condicionalmente essenciais identificados por esta abordagem vão muito além dos parceiros da l, d-transpeptidase para a polimerização do peptidoglicano, incluindo proteínas envolvidas na resposta ao estresse e na montagem de polímeros da membrana externa. Os efeitos inesperados dos β-lactâmicos incluem a perda da ligação covalente mediada por lipoproteínas que liga a membrana externa ao peptidoglicano, a desestabilização do envelope celular, apesar da reticulação eficaz do peptidoglicano, e o aumento da permeabilidade da membrana externa. O último efeito indica que o modo de ação dos β-lactâmicos envolve a penetração autopromovida através da membrana externa.

Bactérias Gram-negativas, como Escherichia coli, possuem um envelope multicamadas que sustenta a pressão de turgescência do citoplasma (peptidoglicano da parede celular) e atua como uma barreira química seletiva para nutrientes, resíduos e compostos tóxicos (membranas internas e externas) (Fig. 1a)1. Vários polímeros contendo porções proteicas, peptídicas, glicanas e lipídicas garantem as propriedades mecânicas e as funções de transporte do envelope. O peptidoglicano (PG), que está covalentemente ligado à membrana externa através da lipoproteína de Braun, é uma macromolécula gigante em forma de rede (ca. 109 Da) polimerizada a partir de uma unidade dissacarídeo-pentapeptídeo (Fig. 1b). As glicosiltransferases catalisam a formação de ligações glicosídicas β-1,4 entre dissacarídeos para formar cadeias de glicano que são subsequentemente reticuladas entre si por transpeptidases (Fig. 1c). Estas últimas enzimas, as d,d-transpeptidases, são também referidas como proteínas de ligação à penicilina (PBPs), uma vez que são os alvos essenciais dos antibióticos β-lactâmicos. Para a polimerização de peptidoglicano, os PBPs interagem com a extremidade d-Ala4-d-Ala5 de uma haste pentapeptídica (daí a designação d, d) e formam uma ligação covalente entre d-Ala4 e seu resíduo Ser do sítio ativo com a liberação concomitante de d -Ala5. Na etapa seguinte, a enzima acil resultante reage com o segundo substrato, mais frequentemente uma haste tetrapeptídica, para formar um dímero Tetra-Tetra reticulado 4 → 3 com a liberação concomitante do PBP (Fig. 1c; Fig. Complementar. S1a)2. Em cooperação com proteínas de andaime e endopeptidases, as d,d-transpeptidases medeiam a inserção de filamentos de glicano na macromolécula em expansão semelhante a uma rede PG, determinando assim a forma bacteriana e garantindo uma barreira mecânica contra a pressão osmótica do citoplasma durante toda a célula ciclo3,4,5,6,7.

a O envelope é composto por membranas interna (IM, cinza) e externa (OM, preta). Peptidoglicano (PG, azul) garante proteção osmótica da célula bacteriana. O IM é uma bicamada lipídica composta principalmente por fosfolipídios (PL). A OM é uma bicamada lipídica assimétrica: o folheto interno é composto por PL e o folheto externo por lipopolissacarídeos (LPS) e fosfatidilglerídeos substituídos pelo antígeno enterobacteriano comum (ECAPGL). b Estrutura da subunidade PG (GlcNAc, N-acetil-glucosamina; MurNAc, ácido N-acetil-murâmico). c PG é uma macromolécula em forma de rede feita de cadeias de glicano (polígonos azul-violeta) interligadas por hastes peptídicas curtas (círculos coloridos). Os PBPs catalisam a formação de ligações cruzadas 4 → 3 conectando a 4ª posição de uma haste doadora de acil à 3ª posição do aceitador. Dois membros da família LDT (YcbB e YnhG) catalisam a formação de ligações cruzadas 3 → 3. Três LDTs (ErfK, YbiS e YcfS) ancoram a lipoproteína de Braun (Lpp) ao PG. A ligação do DAP na 3ª posição de uma haste doadora de PG à extremidade Arg-Lys do Lpp fornece uma ligação covalente entre o OM e o PG. A ligação PG-Lpp é hidrolisada pelo YafK LDT46,47. d Perfil rpHPLC de muropeptídeos da cepa BW25113 (ycbB, relA') cultivados sem ceftriaxona. A estrutura é inferida a partir dos fragmentos obtidos por digestão de PG com muramidases que clivam a ligação MurNAc-GlcNAc β-1,4. e Estrutura dos muropeptídeos deduzida de análises de espectrometria de massa. Os dados de origem são fornecidos como um arquivo de dados de origem.

90% of the resulting muropeptides recycled by the cell37,38. This involves the retrograde transport of PG fragments into the cytoplasm by specialized permeases, AmpG and the Opp complex, followed by the recycling of the sugar and peptide moieties as glucosamine and tripeptide l-Ala-γ-d-Glu-DAP, respectively (Fig. 4a). Tn-seq analysis showed that genes encoding the AmpG permease and each component of the Opp complex were fully dispensable for growth both in −CRO and +CRO conditions. We further demonstrated that PG recycling was fully dispensable by constructing a ΔampG ΔoppF ΔmppA triple mutant that was found to be viable and resistant to ceftriaxone in spite of the loss of both transporters (Supplementary Fig. S3a). Nevertheless, the cytoplasmic l,d-carboxypeptidase LdcA was essential in the +CRO but not in the −CRO condition (Supplementary Data File 1b; Supplementary Data File 2). This enzyme was previously shown to trim d-Ala4 from recycled tetrapeptide stems to provide the l-Ala-γ-d-Glu-DAP tripeptide that is directly added to UDP-MurNAc by the Mpl ligase39,40. Disruption of the gene encoding LdcA was reported to result in bacteriolysis during stationary growth, attributed to dramatically decreased cross-linking as recycled tetrapeptide stems cannot serve as acyl donors by d,d-transpeptidases (Supplementary Fig. S1)40. The same explanation cannot account for the essential role of LdcA in ceftriaxone resistance since YcbB uses tetrapeptide stems as acyl donors8. Nonetheless, the essential role of LdcA in the +CRO condition stemmed from elimination of imported tetrapeptides since deletion of the mpl gene restored growth of the ΔldcA mutant in the presence of ceftriaxone (Supplementary Fig. S3a). Overexpressing murA, encoding the enzyme catalyzing the first committed step of PG synthesis (Fig. 4a), also restored resistance of the ΔldcA mutant (Supplementary Fig. S3b). Thus, boosting the metabolic flux trough the PG assembly pathway compensates for the toxicity of the imported tetrapeptides. Together, these results indicate that Mpl ligates the tetrapeptide onto UDP-MurNAc and that in the absence of LdcA the resulting tetrapeptide-containing precursors are ineffectively used in subsequent PG synthesis steps and impair the global efficacy of the pathway./p> 40-fold reduction of the MIC of the detergent (Fig. 6b). Growth in the presence of ceftriaxone also increased susceptibility to vancomycin, moenomycin, bacitracin, and erythromycin, which are known to poorly penetrate the outer membrane of Gram-negative bacteria (Fig. 6c). Together, these data indicate that bypass of PBPs by YcbB was associated with the permeabilization of the outer membrane in the presence of ceftriaxone. This implies that the mode of action of β-lactams may involve a positive loop in which binding of the drugs to their targets promotes drug access to the periplasm. Damage to the outer membrane mediated by reactive oxygen species (ROS) may be involved in this process since increased lipid peroxidation was detected by a colorimetric assay (Supplementary Fig. S7h)./p> transposome® (Lucigen). For each electroporation, transformed cells were incubated at 37 °C for 1 h in 2 ml of BHI broth supplemented with 10 µg/ml tetracycline and 20 µg/ml chloramphenicol. Cells were plated on 20 BHI agar plates (100 µl per plate) supplemented with 50 µg/ml kanamycin, 40 µM IPTG, and 1% l-arabinose in the absence (condition −CRO) or presence (condition +CRO) of 8 µg/ml ceftriaxone. Plates were incubated at 37 °C for 16 h (condition −CRO) or 24 h (condition +CRO). Cells were recovered from sets of 20 plates (corresponding to the same electroporation) in two steps by scrapping with 4 ml of BHI broth containing 20% glycerol followed by an additional wash of the plates with 4 ml of the same medium. The bacterial suspensions obtained for each electroporation were kept at −80 °C. For the −CRO condition, a total of 810,000 CFUs was obtained in 7 electroporations. For the +CRO condition, a total of 260,000 CFUs was obtained in 10 electroporations./p> 0.05 or a fold-change < 4 were eliminated. The resulting set of 179 genes is listed in Supplementary Data File 1b. For pathways or gene clusters containing selectively essential genes in the +CRO condition, we also considered non-essential genes displaying a significantly reduced number of insertions in the +CRO condition (p < 0.05). These genes were deemed to incur a fitness cost./p>