A geometria de ancoragem é um fator significativo na determinação da direção da cinesina

Scientific Reports volume 12, Artigo número: 15417 (2022) Citar este artigo

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Os motores baseados em microtúbulos Kinesin-14 têm uma cauda N-terminal que fixa o núcleo catalítico à sua carga e geralmente se movem em direção às extremidades negativas dos microtúbulos, enquanto a maioria das outras cinesinas tem uma cauda C-terminal e se movem em direção às extremidades positivas. A perda de sequências conservadas externas ao domínio motor faz com que a cinesina-14 mude para a motilidade da extremidade positiva, mostrando que uma ligação N-terminal é compatível com a motilidade da extremidade positiva. No entanto, não houve nenhum estudo sistemático sobre o papel da posição de fixação na motilidade negativa. Portanto, examinamos a motilidade das cinesina-14 monoméricas, diferindo apenas no seu ponto de ligação. Descobrimos que um ponto de fixação C-terminal faz com que a cinesina-14s se torne direcionada para a extremidade positiva, com direção de rotação em saca-rolhas dos microtúbulos e passo em ensaios de motilidade semelhantes aos da cinesina-1, sugerindo que tanto C-cinesina cinesinas-14 quanto N -kinesin kinesin-1 compartilha uma função central catalítica altamente conservada com um viés intrínseco de extremidade positiva. Assim, uma ligação N-terminal é um dos requisitos para a motilidade da extremidade negativa na cinesina-14.

O movimento unidirecional das proteínas motoras da cinesina ao longo dos microtúbulos é importante em muitos processos celulares em eucariotos, incluindo o transporte de organelas e a divisão celular. Em geral, a maioria das N-cinesinas, como as cinesinas-1 a -10 e -12, nas quais o domínio motor está localizado na parte N-terminal, movem-se em direção às extremidades mais do microtúbulo, enquanto algumas C-cinesinas, como a cinesina-14, nos quais os domínios motores estão localizados na parte C-terminal, movem-se em direção às extremidades negativas do microtúbulo . No entanto, nem todas as cinesinas têm uma motilidade puramente unidirecional e recentemente foi observada mudança direcional em algumas cinesinas de leveduras e fungos. Algumas cinesinas-5, N-cinesinas que normalmente são direcionadas para a extremidade positiva, têm a notável capacidade de também se mover em direção à extremidade negativa dos microtúbulos e mudar de direcionalidade sob várias condições 3,4,5,6,7, enquanto algumas cinesinas-5s, 14 (C-cinesina, que normalmente é direcionada para a extremidade negativa) mostra bidirecionalidade dependente do contexto . Apesar das direções opostas de suas motilidades longitudinais, o núcleo catalítico de N-cinesinas, como a cinesina-1, e as cinesinas C, como a cinesina-14, são notavelmente semelhantes em sua estrutura 3D e sequências de aminoácidos . Além disso, N-cinesinas como as cinesinas-112, -213, -314, -515, -616 e -817 e a C-quinesina cinesina-1418,19 também geram torque, que, juntamente com sua motilidade longitudinal, resulta em uma translocação de microtúbulos em forma de saca-rolhas deslizando através de uma série de motores fixados a uma superfície. Com exceção da cinesina-1 dimérica processiva, que rastreia com precisão um protofilamento individual no microtúbulo20, as N-cinesinas direcionadas para a extremidade positiva conduzem um movimento de saca-rolhas para a esquerda do microtúbulo12, enquanto a cinesina-14 Ncd direcionada para a extremidade negativa conduz um movimento de saca-rolhas para a direita18. Esta inversão da lateralidade do saca-rolhas com a direção sugere que o componente gerador de torque lateral da motilidade da cinesina é exatamente o mesmo em ambos os tipos de motor (Figura 1 Complementar) .

Em contraste com a semelhança de sua estrutura e função central catalítica, a cinesina-1 e a cinesina-14 têm suas próprias regiões únicas adjacentes aos terminais C e N de seu núcleo catalítico, (Fig. 1a e Fig. Complementar 2a, b ). Na cinesina-1, uma região C-terminal de ~ 15 aminoácidos chamada neck-linker, que se estende da hélice α6 no núcleo catalítico, sofre alterações conformacionais induzidas por alterações no estado do nucleotídeo da cinesina . Acredita-se que a conformação de acoplamento deste ligante de pescoço no núcleo catalítico seja o principal evento gerador de força para N-cinesinas. Recentemente, foi sugerido que uma fita β N-terminal chamada fita de cobertura que se projeta do núcleo do motor da cinesina-1 interage com o ligante do pescoço formando um 'feixe de pescoço de cobertura', que modula a geração de força ao longo de ambos os microtúbulos. longitudinal23,24 e eixos laterais curtos25. No entanto, o mecanismo de geração de força de acoplamento do neck-linker não é conservado em todas as N-cinesinas, uma vez que algumas N-cinesinas, como as cinesinas-6 e -10, não possuem regiões típicas do neck-linker . Em contraste com as N-cinesinas, as C-cinesinas cinesinas-14 possuem uma estrutura α-helicoidal única chamada hélice cervical unida diretamente ao terminal N da folha β1 no núcleo catalítico que é altamente conservada em todas as cinesinas. -14 membros28. Foi levantada a hipótese de que um balanço rotacional da hélice do pescoço seja responsável pela geração de força e pela direcionalidade da extremidade negativa nas cinesinas-14, equivalente ao balanço do braço de alavanca proposto para proteínas motoras de miosina baseadas em actina, embora o estado de nucleotídeo em que o oscilações pescoço-hélice permanecem controversas19,30,31,32. Além disso, a cinesina-14 também contém uma região curta C-terminal chamada imitação do pescoço que se projeta da hélice α6. Embora o imitador do pescoço tenha pouca semelhança com o ligante do pescoço das N-cinesinas no nível dos aminoácidos, ele contém vários aminoácidos básicos e um hidrofóbico que são altamente conservados na cinesina-14s33. A imitação do pescoço não foi detectada em estruturas cristalográficas ou de microscopia crioeletrônica de cinesina-14s de tipo selvagem Drosophila melanogaster Ncd30,34 ou Saccharomyces cerevisiae Kar335, mas foi detectada na estrutura do membro KCBP da cinesina-14 (ligação de calmodulina semelhante à cinesina proteína), onde a região C-terminal incluindo o imitador de pescoço se acoplou ao núcleo catalítico da mesma forma que o ligante de pescoço em N-cinesinas . Em Ncd com a mutação única T436S, os três primeiros resíduos da região imitadora do pescoço também se ancoraram no núcleo catalítico . Ensaios bioquímicos e de motilidade também indicam que a imitação do pescoço do Ncd pode regular a afinidade de ligação do Ncd aos microtúbulos e a motilidade direcionada à extremidade negativa . Esses estudos sugerem que a região imitadora do pescoço C-terminal nas cinesinas C também pode estar envolvida na geração de força para a motilidade direcionada à extremidade negativa de maneira semelhante ao ligante do pescoço das N-cinesinas para a motilidade direcionada à extremidade positiva. .